【流式“新生”秘笈】流式通关第六式—神奇的荧光蛋白
文章来源：行业资讯
2021-07-20 13:59:07
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开学啦！BD又给大家送福利了！
流式“新生”秘笈，流式通关第六式来啦！
前面给大家介绍了很多流式基础实验，今天也给大家唠唠和分子生物学，蛋白组学相关的荧光蛋白检测。
随着基因编辑的普及，荧光蛋白被越来越广泛的应用于各个领域的实验。相对于荧光显微镜，流式在进行荧光蛋白的检测时可以更方便的计算阳性细胞百分比，同时更好的进行强度计算，因而在荧光蛋白的测定中有着不可替代的优势。今天小编就给大家带来流式在荧光蛋白领域的应用。
在常见的流式实验中，除了荧光染料和荧光素还有一类荧光物质被广泛的应用于流式实验中，那就是荧光蛋白。荧光蛋白是一种可以在细胞内表达的具有荧光性质的蛋白质。
与荧光染料和荧光素偶联抗体需要与细胞孵育进行染色不同，荧光蛋白通常被表达进细胞内，作为内源的荧光标记。
最早出现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）。1962科学家年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现了。水母体内有一种发光蛋白——Aequorin它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收，从而发出绿色荧光。这种捕获蓝光，发出绿光的蛋白质就是GFP。随着GFP的发现和广泛的应用，越来越多的荧光蛋白被发现，同时科学家们也对已有的荧光蛋白进行了改造，比如对GFP进行改造产生的eGFP相对于GFP更亮；同样是GFP改造而来的CFP和YFP则具有不同的吸收和发射光谱。
目前常用的荧光蛋白通常以发射光的颜色区分，常见分类如下：
用于荧光蛋白检测方法很多，常用的有共聚焦显微镜，荧光显微镜和流式细胞术。他们各有优缺点，相互补充。大家在做不同实验的时候可以参考下表。
严格意义上来说，只要具有相应的激光器，任何的荧光蛋白都可以用于流式检测。但是实际应用当中用于激发青色荧光蛋白的445nm激光，激发黄色荧光蛋白的532nm激光都只有极少的流式仪器才会选配，但是BD FACSymphony A5就有多种激光器可供定制选择。具体信息可咨询当地销售。
小编辛苦为大家整理了在常规流式细胞仪上常用荧光蛋白：
荧光蛋白最大优势是其固有的遗传编码性质，这允许使用基本的分子生物学和克隆技术将高度特异性引入到研究系统中。
观察目的基因表达情况。
观察启动子活性。
质粒转染效率判断。
流式细胞仪目前检测细胞内蛋白质和蛋白质之间相互关系的方法主要有两种：
荧光能量共振转移（Forster Resonance Energy Transfer, FRET）是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，且仅在非常短的距离（通常在10 nm内）内发生，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。
作为共振能量转移供发生条件：
① 供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠（30%）；
② 供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm；
图片来源于：Application of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) technique to elucidate intracellular and In Vivo biofate of nanomedicines.2019
FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。
我们总结了比较适合于流式的可以发生FRET的荧光素对：
双分子荧光互补技术（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）是一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法使用拴系到潜在蛋白质相互作用伙伴的分裂荧光蛋白质。与FRET不同，BiFC仅使用单个荧光蛋白来研究蛋白间相互作用。该荧光蛋白（FP）分为两个单独缺少荧光的片段。当互补的FP片段与两个假设的蛋白质相互作用伴侣（PIP）融合时，FP片段形成完整的FP，因为它们被束缚在一起以使它们紧密接近。完整FP的形成会产生荧光信号，可以通过流式细胞仪检测到。
图片来源于：https://blog.addgene.org/bimolecular-fluorescence-complementation
BiFC分析中使用的荧光蛋白，我已经帮大家搜罗如下，可以点击保存。
图片来源于：Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives
需要回答两种蛋白质是否相互作用，且不用检测相互解离过时，用BiFC技术方法；当蛋白质间作用的时间动态成为研究重点时，推荐FRET技术方法。
荧光蛋白与其他蛋白质及蛋白质结构的融合产生了大量的遗传编码生物传感器，能够提供蛋白质-蛋白质相互作用、特定分子的存在或活性，以及生命系统信号的时空调控等信息。
例如：
结合流式分选技术更可以将带有荧光蛋白的细胞进行纯化培养或分选后进入下游实验，进行深入研究。
图片来源于：http://2010.igem.org/FACS_analysis_of_fluorescent_proteins
看完了上面的荧光蛋白介绍，各位小白们是不是跃跃欲试啦？作为流式小白，我们还是先从操作简单的BD Accuri™ C6 Plus开始吧！
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好啦，本期的荧光蛋白流式检测专题就为大家介绍到这里，相信大家对流式应用的掌握越来越多了！关注BD生物科学，有更多的专题供大家一起学习哦！推荐【BD精选文章】，该专题会带领大家一起打开顶级期刊的扉页，开启流式高阶应用的思想盛宴~
参考文献：
[1] Duwé Sam,Dedecker Peter,Optimizing the fluorescent protein toolbox and its use.[J] .Curr Opin Biotechnol, 2019, 58: 183-191.
[2]Ni, Q., Mehta, S. and Zhang, J. (2018), Live‐cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. FEBS J, 285: 203-219
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